本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測定方法達到很高的敏感度。 ELISA可用于測定抗原,也可用于測定抗體。
然而,影響ELISA試驗結(jié)果的因素很多,故加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點。
ELISA試劑盒的操作方法
雙抗體夾心法
1.包被:用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1~10μg/ml。在每個板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4℃ 過夜。次日,棄去孔內(nèi)溶液,用洗滌緩沖液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。
2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標抗體:于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。
4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。
5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強,陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以"+"、"-"號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。
間接法
1.用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜;
2.次日洗滌3次;
3.加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中,置37℃孵育1小時,洗滌;
4.(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml;
5.37℃孵育35-60分鐘,洗滌;
6.'后一遍用DDW洗滌。
其余步驟同"雙抗體夾心法"的4、5、6。
ELISA試劑盒試驗的注意事項
1、要保證移液槍的準確性,誤差不能超過2%??捎盟碗娮犹炱竭M行確定。但需要有專業(yè)人員進行矯正。
2、要配備20ul、50ul、100ul、1000ul和排槍各一支。吸取不同的液體后,要更換槍頭。即使是吸取標準品時。
3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出,使各種試劑都恢復(fù)到室溫,以使結(jié)果更穩(wěn)定。
4、實驗時,要使底物避光保存。
5、用槍吸取液體時速度不能太快,以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確。
6、吸取液體時,要用量程和需要量接近的槍去吸,減少誤差。
7、將液體加到酶標孔中時,避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸,可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,液滴會自然流下去。
8、液體全部加完后,可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒,混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能。
9、溫浴時,要用不干膠或膠帶紙封好酶標板,防止水分的蒸發(fā)。
10、洗板時,每次洗液加入后,應(yīng)靜置1分鐘,使清洗更加*。沒有洗板機時,倒去液體后,要將酶標板在報紙或毛紙上用力拍干。
11、洗液不夠時,可用蒸餾水自行配制PH7.4,0.02M的磷酸緩沖液,加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長期保存。
12、底物是光敏感的,要在臨用前現(xiàn)配。
13、檢測前,要打開酶標儀,使之穩(wěn)定10分鐘以上。
14、底物有一定的毒性,終止液對皮膚有腐蝕性,應(yīng)盡量避免接觸。
15、待檢樣品要澄清,否則會影響結(jié)果。
16、溫浴時間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。
17、應(yīng)盡量做雙孔實驗,這樣才能保證數(shù)據(jù)的準確性。
18、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。
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